1.本发明涉及植物活性成分提取技术领域，尤其是涉及一种从黑果腺肋花楸果中提取原花青素的方法。

  2.原花青素(opc)是自然界中广泛存在的一种多酚化合物。研究表明，原花青素具有强大的抗氧化作用，可清除自由基，近年又发现其具有防治心血管疾病、抗辐射、免疫调节等多种功效。目前，原花青素作为营养强化剂、天然抗氧化剂、天然防腐剂等，被大范围的应用于食品、药品和化妆品等领域。

  3.黑果腺肋花楸又名野樱莓、不老莓，原产于北美，现在我国东北、内蒙、甘肃等省市均有种植，是集食用、药用、园林和生态价值于一身的蔷薇科落叶灌木。黑果腺肋花楸果实富含黄酮、花青素、原花青素、多酚等物质，2018年被国家卫健委公告为新食品原料。有关联的资料显示，黑果腺肋花楸果实中花青素、黄酮(鲜果含量高达0.25％

  0.35％)、多酚是已知植物中含量最高的，原花青素含量是蓝莓的2.5倍。黑果腺肋花楸是提取原花青素的优选原料，其经榨取果汁后的果渣，仍然富含原花青素，将其废物利用，可有效解决废渣排放的污染问题和利用率低的问题，促进花楸深加工产业的发展，提升黑果腺肋花楸的附加值。

  4.现有原花青素提取技术可分为水提取法、有机溶剂提取法、微波提取法、超声波提取法、超临界co2萃取提取法等。水提取法提取温度高，时间长，易引起原花青素的损失；有机溶剂提取存在萃取溶剂消耗量大，对环境造成污染，溶剂残留毒性等缺点；微波辅助提取法、超声波提取法及超临界co2萃取提取法尚处于实验室阶段，工业推广使用还存在一定困难。

  7.本发明的目的是提供一种从黑果腺肋花楸果中提取原花青素的方法，该方法能够降解果渣细胞壁以利于原花青素溶出，从而最大限度地将果渣中的原花青素提取出来，原花青素的提取率高。

  10.b)采用黑曲霉、绿色木霉和地衣芽孢杆菌对果渣进行发酵，得到果渣发酵液；

  11.c)将果汁与果渣发酵液混合得到混合液，采用果胶酶和木瓜蛋白酶对混合液进行酶解，得到酶解液；

  13.本发明的方法采用黑曲霉、绿色木霉和地衣芽孢杆菌多菌种联合发酵产生的纤维素酶等酶系降解果渣细胞壁以利于原花青素的溶出，上述真菌和细菌构建的混合培养体系可实现酶系互补、功能互补、生长互促；同时，结合外源的果胶酶和木瓜蛋白酶来二次酶解发酵后果渣中的果胶、蛋白等成分，从而能够将残留在果渣中的原花青素最大限度地提取出来。上述两段酶解工艺克服了传统原花青素提取中温度比较高、有机试剂用量多等缺点，两段酶解相互配合、协同作用，明显提高了果渣中原花青素的提取率。

  14.在本发明的步骤a)中，能够正常的使用目前食品加工技术领域里通常使用的设备做捣碎，如破碎机、打浆机等；捣碎后的过滤为过100

  200目筛，目数的大小影响果汁的过滤效果，如＜100目，则细小果渣颗粒无法去除，达不到过滤效果；如＞200目，则果浆过滤时间太长，影响生产效率。

  16.向液体培养基中加入果渣，随后接种黑曲霉、绿色木霉和地衣芽孢杆菌进行发酵；其中，液体培养基的组成可以为：蛋白胨0.2

  500g/l。果渣的加入量影响原花青素的提取率，如加入量＜200g/l，则料液比太大，生产所带来的成本增加；如加入量＞500g/l，则料液比太小，果渣无法与溶液充分接触，原花青素的提取率下降。

  18.由于黑果腺肋花楸的果渣中仍含有大量的原花青素，如何破坏果渣的细胞壁，使原花青素释放开来成为提取的关键。研究之后发现：单一微生物或同类微生物的酶系和产酶能力具有一定的局限性，从而很难完全地对果渣中的纤维素进行降解，且降解效果不够理想；而采用本发明上述黑曲霉、绿色木霉、地衣芽孢杆菌多菌株联合发酵产生的纤维素酶等酶系，可以将果皮及果肉纤维的细胞壁中大分子纤维降解为小分子多糖，使残留在果渣中的原花青素有效溶出，进而提高原花青素的提取率。

  19.本发明中使用的黑曲霉、绿色木霉、地衣芽孢杆菌均为目前市场上常规销售的产品。

  20.在本发明的步骤c)中，果胶酶和木瓜蛋白酶(合称为复合酶)的总用量可以是混合液重量的0.05

  21.优选地，复合酶可以由60重量份果胶酶和40重量份木瓜蛋白酶组成，果胶酶的酶活为1

  22.步骤a)的果汁经过滤后可去除果皮、果渣等颗粒物，但果汁中的大分子蛋白、果胶等物质跟着时间的延长会出现絮沉现象，常规的离心等方式很难彻底清除；加入果胶酶和

  木瓜蛋白酶可将这些大分子物质降解为水溶性的小分子组分，来提升果汁的澄清度，并提高原花青素产品的纯度和水溶性。

  23.同时，黑曲霉、绿色木霉、地衣芽孢杆菌发酵产生的纤维素酶等酶系虽然能够将细胞壁中的纤维素软化分解，然而果渣中的大分子果胶、蛋白等成分仍会包裹部分原花青素，采用果胶酶和木瓜蛋白酶继续酶解果渣，可进一步提升果渣中原花青素的提取率。

  24.在本发明中，复合酶的重量为混合液重量的0.1％以上时，则原花青素的溶出速度缓慢，造成酶用量的浪费；复合酶的重量为混合液重量的0.05％以下时，则原花青素不能充分溶出，提取率下降；因此，复合酶的重量控制在混合液重量的0.05

  0.1％是合适的。此外，果胶酶、木瓜蛋白酶的用量低于或高于上述范围都可能会导致营养成分的溶出速度下降，因此，上述果胶酶和木瓜蛋白酶的酶量范围是合适的。

  26.在酶解时，酶解反应温度如果低于45℃，则酶解反应不完全，原花青素溶出的速度缓慢；如果高于55℃，则酶解反应进行不完全，酶的活性受到抑制；因此，酶解温度控制在45

  55℃的条件下，如果酶解反应时间小于4小时，则酶解反应进行不完全，原花青素不能全部溶出；如果酶解反应时间超过10小时，则酶解反应趋于平缓，造成能源浪费；因此，酶解时间控制在4

  27.此外，由于黑曲霉、绿色木霉和地衣芽孢杆菌的发酵条件趋于中性，并且酶解反应的ph值也在中性范围内，因此发酵结束后的发酵液无需调整ph值即可满足果胶酶和木瓜蛋白酶的最适工作条件。

  28.本发明中所用的酶均为目前市场上常规销售的产品；例如，苏柯汉(潍坊)生物工程有限公司销售的果胶酶、南宁庞博生物工程有限公司销售的木瓜蛋白酶等。

  29.在本发明的步骤d)中，分离提纯可以包括粗提；其中，粗提可以包括：对酶解液进行过滤，得到滤液；对滤液进行浓缩、干燥，得到原花青素粗提物。

  30.具体地，对酶解液的过滤能够使用离心过滤，离心过滤所使用的设备能采用目前市场上常规销售的高速离心机，如碟片离心机及管式离心机等；离心分离条件能够准确的通过所使用离心机操作说明书说明的条件进行。

  31.对滤液进行的浓缩所使用的设备能是目前市场上销售的浓缩设备，如三效浓缩器、刮板浓缩器、球形浓缩器等。浓缩液的固含量达到20％以上时，停止浓缩，以喷雾干燥等干燥方式来进行干燥，即可得到原花青素粗提物，该原花青素粗提物中原花青素含量≥35％；其中，原花青素含量的检测依照《保健食品理化及卫生指标检验与评价技术指导原则(2020年版)》中的方法执行。

  32.进一步地，步骤d)中，分离提纯还可以包括在粗提之后进行的精提；其中，精提包括：利用x

  55％的乙醇溶液进行解吸，洗脱直至下柱水无颜色，收集解吸液并浓缩、干燥，得到原花青素精提物；其中，能控制吸附速率为2

  5型大孔树脂选择性吸附纯化原花青素，能轻松的获得更高含量的原花青素精提物，该原花青素精提物中原花青素的含量≥92％。

  34.上述步骤d)可以分别制备不同纯度的原花青素产品，当所需原花青素产品纯度较低时，可以仅采用粗提步骤直接浓缩干燥制备原花青素粗提物，省去了大孔树脂纯化的步

  骤，节省成本；当所需原花青素产品纯度较高时，可进一步采用精提步骤进行纯化，再浓缩干燥，从而制备出高纯度的原花青素精提物。

  36.本发明从黑果腺肋花楸果中提取原花青素的方法，采用黑曲霉、绿色木霉和地衣芽孢杆菌多菌种联合发酵产生的纤维素酶等酶系降解果渣细胞壁以利于原花青素的溶出，上述混菌发酵可实现酶系互补、互利共生，弥补了单一菌株产酶能力弱、酶解效果差等缺点；此外，利用外源的果胶酶和木瓜蛋白酶二次酶解果渣中的果胶和蛋白等物质，能够将残留在果渣中的原花青素最大限度地提取出来，提高了果渣中原花青素的提取率。上述方法能够对果渣进行废物利用，提高了企业的经济效益，有助于延长黑果腺肋花楸产业链；由多菌种混菌发酵和复合酶酶解构成的两段酶解工艺克服了传统原花青素提取中温度比较高、有机试剂用量多的缺点，整个工艺条件温和，所需设备简单，可实现规模化及产业化生产，促进了花楸深加工产业的发展，提升了黑果腺肋花楸的附加值。

  37.为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现存技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现存技术描述中所需要用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还能够准确的通过这些附图获得其他的附图。

  39.应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

  40.需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本申请的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外精确指出，否则单数形式也包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。

  41.下面将结合实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

  49.参见图1，本实施例从黑果腺肋花楸果中提取原花青素的方法，步骤如下：

  53.向发酵罐中加入去离子水，按照0.2g/l蛋白胨、2g/l氯化钠、10g/l硫酸镁与5g/l磷酸氢二钾配制液体培养基，随后将上述果渣按照200g/l的投加量投入到液体培养基中。

  54.向投加果渣的液体培养基中接种黑曲霉、绿色木霉和地衣芽孢杆菌，接种量分别为果渣量的0.5％、0.2％和0.2％；在发酵温度30℃、通气量1:1.0、压力0.05mpa、转速120rpm的条件下恒温搅拌发酵20h，得到黑果腺肋花楸果渣发酵液。

  57.向上述混合液加入复合酶进行酶解，复合酶的添加量是混合液重量的0.05％，果胶酶与木瓜蛋白酶的重量配比为1：1，果胶酶的酶活为0.5

  59.将上述黑果腺肋花楸果酶解液离心过滤除杂，收集滤液后，对滤液进行浓缩、喷雾干燥，得到原花青素粗提物。经检测，该原花青素粗提物中原花青素的含量为36.4％。

  65.向发酵罐中加入去离子水，按照10g/l蛋白胨、0.2g/l氯化钠、0.2g/l硫酸镁与10g/l磷酸氢二钾配制液体培养基，随后将步骤1)的果渣按照500g/l的投加量投入到上述液体培养基中。

  66.向投加果渣的液体培养基中接种黑曲霉、绿色木霉和地衣芽孢杆菌，接种量分别为果渣量的0.1％、0.1％和1％；在发酵温度28℃、通气量1:1.2、压力0.04mpa、转速100rpm的条件下恒温搅拌发酵30h，得到黑果腺肋花楸果渣发酵液。

  69.向上述混合液加入复合酶进行酶解，复合酶的添加量是混合液重量的0.1％，果胶酶与木瓜蛋白酶的重量配比为2：1，果胶酶的酶活为1

  104u/g，在酶解温度45℃下酶解10h，得到黑果腺肋花楸果酶解液。

  5型大孔树脂动态吸附，45％浓度乙醇解吸，吸附解吸速率均为3bv/h，洗脱直至下柱水无颜色，收集解吸液并浓缩、喷雾干燥，得到原花青素精提物。经检测，该原花青素精提物中原花青素的含量为93.8％。

  78.向发酵罐中加入去离子水，按照2g/l蛋白胨、10g/l氯化钠、5g/l硫酸镁与0.2g/l磷酸氢二钾配制液体培养基，随后将步骤1)的果渣按照300g/l的投加量投入到上述液体培养基中。

  79.向投加果渣的液体培养基中接种黑曲霉、绿色木霉和地衣芽孢杆菌，接种量分别为果渣量的0.3％、0.5％和0.5％；在发酵温度32℃、通气量1:1.1、压力0.06mpa、转速200rpm的条件下恒温搅拌发酵22h，得到黑果腺肋花楸果渣发酵液。

  82.向上述混合液加入复合酶进行酶解，复合酶的添加量是混合液重量的0.06％，果胶酶与木瓜蛋白酶的重量配比为1.5：1，果胶酶的酶活为1.5

  5型大孔树脂动态吸附，55％浓度乙醇解吸，吸附解吸速率均为4bv/h，洗脱直至下柱水无颜色，收集解吸液并浓缩、喷雾干燥，得到原花青素精提物。经检测，该原花青素精提物中原花青素的含量为92.6％。

  91.向发酵罐中加入去离子水，按照5g/l蛋白胨、2g/l氯化钠、1g/l硫酸镁与5g/l磷酸氢二钾配制液体培养基，随后将步骤1)的果渣按照300g/l投入到上述液体培养基中。

  92.向投加果渣的液体培养基中接种黑曲霉、绿色木霉和地衣芽孢杆菌，接种量分别为果渣量的0.2％、0.2％和0.5％；在发酵温度29℃、通气量1:1.0、压力0.05mpa、转速150rpm的条件下恒温搅拌发酵24h，得到黑果腺肋花楸果渣发酵液。

  95.向上述混合液加入复合酶进行酶解，复合酶的添加量是混合液重量的0.06％，果胶酶与木瓜蛋白酶的重量配比为2：1，果胶酶的酶活为1

  97.将上述黑果腺肋花楸果酶解液离心过滤除杂，收集滤液后，对滤液进行浓缩、喷雾干燥，得到原花青素粗提物。经检测，该原花青素粗提物中原花青素的含量为40.3％。

  101.将黑果腺肋花楸果实机械捣碎成浆后过120目筛，得到果汁和果渣。

  103.向发酵罐中加入去离子水，按照4g/l蛋白胨、2g/l氯化钠、0.5g/l硫酸镁与5g/l磷酸氢二钾配制液体培养基，随后将步骤1)的果渣按照400g/l投入到上述液体培养基中。

  104.向投加果渣的液体培养基中接种黑曲霉、绿色木霉和地衣芽孢杆菌，接种量分别为果渣量的0.4％、0.4％和0.6％；在发酵温度31℃、通气量1:1.1、压力0.05mpa、转速180rpm的条件下恒温搅拌发酵28h，得到黑果腺肋花楸果渣发酵液。

  107.向上述混合液加入复合酶进行酶解，复合酶的添加量是混合液重量的0.08％，果胶酶与木瓜蛋白酶的重量配比为1.5：1，果胶酶的酶活为1

  5型大孔树脂动态吸附，50％浓度乙醇解吸，吸附解吸速率均为2bv/h，洗脱直至下柱水无颜色，收集解吸液并浓缩、喷雾干燥，得到原花青素精提物。经检测，该原花青素精提物中原花青素的含量为95.8％。

  112.采用乙醇浸提法从黑果腺肋花楸果中提取原花青素，料液比1：20，乙醇浓度为50％，提取温度为70℃，提取时间为7h，其它步骤参照实施例5。

  114.使用水提法从黑果腺肋花楸果中提取原花青素，料液比1：20，提取温度为90℃，提取时间为7h，其它步骤参照实施例5。

  116.仅使用微生物发酵法从黑果腺肋花楸果中提取原花青素，即仅采用黑曲霉、绿色木霉和地衣芽孢杆菌进行发酵(不包括复合酶酶解步骤)，其它步骤参照实施例5。

  118.仅使用酶解法从黑果腺肋花楸果中提取原花青素，即仅采用果胶酶和木瓜蛋白酶进行酶解(不包括微生物发酵步骤)，其它步骤参照实施例5。

  120.除微生物发酵步骤中，仅接种黑曲霉和绿色木霉进行发酵外，其它与实施例5基本相同。

  122.除采用枯草芽孢杆菌替换实施例5中的地衣芽孢杆菌外，其它与实施例5基本相同。

  124.仅使用酶解法从黑果腺肋花楸果中提取原花青素(不包括微生物发酵步骤)，且所

  采用的混合酶由纤维素酶、果胶酶和木瓜蛋白酶组成，其它步骤参照实施例5。

  126.除采用菠萝蛋白酶替换实施例5中的木瓜蛋白酶外，其它与实施例5基本相同。

  128.微生物发酵采用米曲霉、乳酸菌和酵母菌组成的复合菌，酶解采用木聚糖酶和淀粉酶，其它步骤参照实施例5。

  9的方法提取黑果腺肋花楸原花青素后，测定提取率和原花青素纯度，提取率计算公式如下：

  [0133] 原花青素提取率，％原花青素纯度，％实施例52.3795.8对比例11.9494.6对比例21.4293.7对比例31.8392.3对比例41.6493.1对比例51.9193.5对比例61.8792.4对比例71.7392.6对比例81.9394.2对比例91.3891.3

  1、采用传统的乙醇浸提和水提法提取的原花青素提取率均较低，可能是由于提取过程中的高温导致原花青素部分分解，含量下降；

  2、对比例3的单一微生物发酵法和对比例4的单一酶解法中的原花青素提取率都较实施例5低，说明微生物发酵结合外源酶解的两段酶解工艺可将黑果腺肋花楸果皮及果肉纤维的细胞壁充分降解，原花青素最大限度释放开来，大幅度提高原花青素的提取率；

  3、对比例5仅接种黑曲霉和绿色木霉，对比例6采用枯草芽孢杆菌，原花青素提取率都较实施例5低，说明采用同类菌群或别的类型的芽孢杆菌无法使果渣中的细胞壁充分降解，原花青素的提取率大大降低；

  4、对比例7采用外源的纤维素酶与果胶酶和木瓜蛋白酶进行酶解，效果远不及微生物发酵生成的复合酶系；实施例8采用菠萝蛋白酶同样无法使原花青素最大限度释放出来。

  5、对比例9采用米曲霉、乳酸菌和酵母菌组成的复合菌进行微生物发酵，并采用木聚糖酶和淀粉酶组成的复合酶进行酶解，原花青素的提取率较实施例5大幅度的降低，说明本发明的复合菌和复合酶不是随机选择的，是优选的对花楸果细胞壁的降解具有独特优势的组合，其它复合菌及复合酶对花楸果细胞壁的降解效果较弱，原花青素的释放效果受到很大限制。

  由此表明：只有采用黑曲霉、绿色木霉和地衣芽孢杆菌多菌种联合发酵产生的纤维素酶等酶系降解果渣细胞壁，同时利用外源的果胶酶和木瓜蛋白酶二次酶解果渣中的果胶和蛋白等物质，方能将残留在果渣中的原花青素最大限度地提取出来，从而大幅度提高果渣中原花青素的提取率。

  最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案做修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

  技术研发人员：高小佳;额尔敦巴雅尔;朱孔山;张洪敏;符琳琳;刘洪钧;葛振宇;徐志文